Cell | 微生物来源的乳酸促进肠干细胞介导的上皮细胞发育

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微生物来源的乳酸促进肠干细胞介导的上皮细胞发育

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文章截图，图片来源：参考[1]

导读

肠道干细胞位于肠黏膜隐窝基底部，即基底隐窝是肠道干细胞的细胞库。正常情况下，位于隐窝基底部的肠道干细胞不断向隐窝顶部(肠腔方向)迁移，整个迁移过程大约3-5d，在迁移过程中肠道干细胞分化形成不同的肠黏膜细胞。————引用自《百度百科》[1]
前段时间南京农业大学-动物医学院的庾庆华教授在《Cell Death & Differentiation》上发表了一篇类似的工作，也是介绍了乳酸杆菌如何通过STAT3信号通路途径来保护肠粘膜的一个完整性。————参考[2,3]
那么在这篇文章中，主要介绍了：

1. 揭示了乳酸产生菌-双歧杆菌和乳杆菌，是如何促进肠上皮细胞的再生的；
2. 共生菌产生的乳酸通过位于潘氏细胞和基质细胞上的G-蛋白偶联受体-81**Wnt3/β-连环蛋白途径从而促进肠上皮细胞的再生；
3. 通过预先灌喂小鼠乳酸盐可以保护暴露于辐射以及化学疗法的小鼠免受肠道损伤

文章介绍

英文标题：Microbiota-Derived Lactate Accelerates Intestinal Stem-Cell-Mediated Epithelial Development[4]
译名：微生物来源的乳酸促进肠道干细胞介导的上皮细胞发育
期刊：Cell Host & Microbe
IF：17.872
通讯作者：Mi-Na Kweon
研究领域：黏膜免疫，微生物学
通讯地址：粘膜免疫实验室, 融合医学系, 蔚山大学医学院/峨山医学中心, 首尔
DOI：10.1016/j.chom.2018.11.002

材料与方法

样品采集

6-8周大的小鼠，品种有C57BL/6N和Lgr5-GFP（雌雄数目均等）。动物通过麻醉后进行各种取样流程。符合伦理学操作规程。

试验方法

类器官（肠上皮隐窝细胞、基质细胞分离）培养、CRISPR/Cas9基因编辑获得Gpr81-/-小鼠、益生菌（植物乳杆菌）和乳酸盐的灌喂实验、肠道渗透性实验、免疫组化、RNA原位杂交等分子生物学实验

主要研究结果

1.共生细菌产生的乳酸是肠道干细胞介导的肠上皮细胞再生的关键因子

Lgr5-GFP小鼠口服人用益生菌（包含乳酸产生菌-双歧杆菌和乳杆菌属）5天后，发现其隐窝高度、肠干细胞、潘氏细胞和杯状细胞数目均高于对照组小鼠，而且还能增加抗菌肽的分泌。通过对益生菌的代谢物进行分析发现乳酸的水平在小肠和大肠内容物中均比对照小鼠更高。

另外，通过将小肠隐窝细胞与益生菌培养的上清液，或者和添加了表皮生长因子、头蛋白、R-脊椎蛋白-1的含乳酸培养基共培养3天，发现小肠隐窝类器官的尺寸显著增加。相反的是，如果添加了乳酸盐的拮抗剂（3-羟基丁酸）后，尽管乳酸充足，但还是抑制了类器官的生长和再生。

结果发现与益生菌上清液和含乳酸的培养基共培养后，Wnt3/β-连环蛋白途径相关的基因表达显著上升，如Wnt3, Ctnnb1, Axin2和GSK3β。但是乳酸的拮抗剂则明显抑制这些基因的**（Fig. 1）。

2.灌喂的乳酸盐可以到达隐窝底部

为了确证乳酸产生菌产生的乳酸是否会到达肠隐窝而发挥作用，作者通过测定灌喂乳酸和空白小鼠的肠隐窝的氧消耗率（OCR，氧化磷酸化的指标）和细胞外酸化速率（ECAR，糖酵解的指标），发现灌喂了乳酸的肠隐窝OCR更高，而ECAR没有差异。

总之，该结果表明在灌喂了乳酸过后，肠隐窝细胞线粒体相关的呼吸作用增强了，说明乳酸可以达到隐窝底部。

3.乳酸和基质细胞的Gpr81互作是Lgr5(G蛋白偶联受体5)+肠干细胞分化的重要因素

通过向小肠类器官中添加乳酸或者Gpr81激动剂（3-氯-5-二羟基苯甲酸，3,5-DHBA）来研究诱导Wnt3信号表达的主要因子。发现3,5-DHBA可以提高小肠隐窝Lgr5+细胞
和Ki67+细胞的增殖。

潘氏细胞的Gpr81的表达通过原位杂交和免疫荧光技术确认。Gpr81在Lyz1+纯化的隐窝潘氏细胞和aSMA+肠基质细胞的共表达也是通过免疫组化染色的技术发现的。另外一项研究表明肠道基质细胞细胞可以表达与Wnt信号相关的细胞因子从而有助于肠上皮细胞的生长。最近的一项研究发现肠上皮下的间叶细胞可以高水平表达Wnt2b，其是肠上皮细胞更新换代的基础。因此作者猜想，除了潘氏细胞，基质细胞也可以因为乳酸-Gpr81相互作用而对肠干细胞的增殖发挥作用。

通过原位杂交染色技术，作者筛选到了几种Wnt信号的表达模式，如Wnt3和Wnt2b，因为加了益生菌或者乳酸而被**。也发现高水平的Wnt2b可以自发的在肠基质细胞表达，与Wnt3类似，乳酸也可以促进Wnt2b在肠基质细胞的表达

结果说明潘氏细胞和肠基质细胞是Lgr5+肠干细胞增殖必可不少的，且可以通过乳酸-Gpr81途径**（Fig. 2）。

4.缺少乳酸脱氢酶的植物乳杆菌不能诱导肠干细胞的增殖

为了进一步探究微生物来源乳酸对肠干细胞生态位的作用，这里比较了野生型植物乳杆菌和敲除乳酸脱氢酶基因的植物乳杆菌（L. plantarum ldhD(-)-DldhL(-)）。如预期，缺失了乳酸脱氢酶基因的植物乳杆菌的培养上清液中没有检查到有乳酸的分泌。并且观察到当肠道类器官与乳酸脱氢酶基因缺陷的植物乳杆菌上清液共培养后发现肠类器官的大小、类器官Lgr5+ 和 Ki67+细胞的数目均低于共正常植物乳杆菌共培养的类器官。

另外还比较了饲喂益生菌、乳酸、野生型植物乳杆菌、ldhD-ldhL基因敲除植物乳杆菌发现，一些已知的肠上皮细胞marker，如Lyz1,Muc2和Olfm4在益生菌、乳酸、野生植物乳杆菌组中表达更高。这些结果说明乳酸在肠干细胞增殖中发挥了关键的作用（Fig. 3）。

5.新生小鼠对乳酸介导的肠干细胞增殖水平更高

因为新生小鼠肠道中主要为乳酸产生菌，作者推测乳酸是肠道中丰度最高的代谢物并且可能是促进小肠肠组织成熟发育的关键因素。因为作者从3日龄的Lgr5-GFP小鼠中分离小肠细胞制得小肠类器官。与成年小鼠的结果类似，经过乳酸、Gpr81激动剂、NBGC处理可以促进小肠类器官中肠干细胞的增殖。

通过乳酸刺激肠基质细胞对球形类器官有很大的效应。除此之外，通过乳酸刺激新生小鼠小肠类器官基质细胞可以高效的**与Wnt/β-连环蛋白途径相关的基因的表达。即乳酸对新生小鼠小肠类器官肠干细胞的增殖效应大于成年小鼠（Fig. 4）。

6.提前暴露在肠道环境是肠干细胞正常增殖的先决条件

通过分离SPF和GF新生小鼠小肠组织培养类器官，发现GF小鼠来源的肠干细胞增殖有缺陷，但是通过添加乳酸后又能逐渐恢复其增殖（Fig. 5A），而且CD24和Wnt3在GF小鼠类器官中的表达是更低的（Fig. 5B）,同理，重新加入乳酸后Wnt3表达恢复了。

另外，通过抗生素处理后发现隐窝扭曲和潘氏细胞的颗粒减少，但是加入乳酸后该症状得到缓解（Fig. 5C），且使得杯状细胞数目恢复正常（Fig. 5D）。

最后，为了说明菌的作用，分别对6周龄的无菌小鼠灌喂野生型植物乳杆菌和LdhD-LdhL基因缺陷型植物乳杆菌，发现灌喂了野生型正常植物乳杆菌的无菌小鼠其潘氏细胞数目显著更高（Fig. 5E）。这些结果说明乳酸足够刺激无菌小鼠肠干细胞的增殖，并且只要提前暴露在乳酸产生菌的环境下，就可以引起不依赖于共生菌的Wnt3**肠干细胞增殖效应。

7.提前饲喂益生菌和乳酸保护小鼠免受肠道损伤

为了进一步阐明来源于益生菌的乳酸对肠道的保护作用，用辐射和氨甲蝶呤（研究报道该处理方法会对小肠上皮细胞有损害作用）处理小鼠。发现饲喂了益生菌或者乳酸的小鼠能够抵抗辐射和氨甲蝶呤环境引起的小肠隐窝和绒毛损伤。同理，类器官的结果也得到验证（Fig. 6）。

8.Gpr81缺失因为Wnt3信号通路的失活而损坏肠干细胞介导的肠上皮细胞再生

为了确定乳酸受体Gpr81在肠干细胞介导的肠上皮细胞的再生作用，通过CRISPR/Cas9基因敲除技术制备了Gpr81-/-（Gpr81受体基因敲除）小鼠。可以发现Lgr5+，Olfm4+细胞, Lyz1细胞, Muc2+细胞以及杯状细胞和潘氏细胞数目在Gpr81敲除鼠的小肠显著降低（Fig. 7A），同时观察到Gpr81-/-小鼠的小肠类器官大小和数目更少（Fig. 7B）。

免疫组化实验发现Gpr81-/-小鼠小肠类器官的Lgr5和Wnt3的表达也降低了（Fig. 7C），western-blot实验也发现Wnt蛋白表达水平降低（Fig. 7D）

尝试通过乳酸、Gpr81激动剂、益生菌培养上清液去刺激Gpr81-/-小鼠，发现这些刺激因子均无法**基因敲除鼠小肠类器官的Wnt3a的分泌（Fig. 7E）。但是添加Wnt3a后可以使小肠类器官生长得到恢复（Fig. 7F）。说明Gpr81的基因敲除是通过Wnt3失活而破坏肠干细胞介导的肠上皮细胞再生功能的。

研究结论

• 该研究证明了通过灌喂乳酸产生菌，如双歧杆菌和乳酸杆菌，可以显著促进 Lgr5+ 肠干细胞的增殖和肠上皮细胞的发育，并且在体内和间接体外实验得到重现。

• 以前的研究认为乳酸作为碳代谢的一种中间代谢物具有抗菌效应，但是最近关于乳酸生物活性的报道越来越多，比如其可以调控免疫反应和肠粘膜的组织再生。

• 很多研究都在期望找到共生菌产生的代谢物与G-蛋白偶联受体之间的相互作用机制。Gpr81主要在脂肪细胞中表达，并且乳酸-Gpr81的互作可以抑制脂类的分解代谢。乳酸可以通过Gpr81介导的先天性免疫的负调控和缓解肝脏和胰腺损伤来减少炎症。

• 我们发现，乳酸刺激导致Gpr81内化到肠基质细胞的胞质膜，并通过**PORCN信号通路诱导Wnt3细胞因子的表达。

• 我们的结果表明乳酸盐通过Gpr81**Wnt3-β-连环蛋白通路直接刺激CD24+潘氏细胞和aSMA+肠基质细胞，在维持Lgr5+ 肠干细胞的多能性中发挥重要作用。

潜在研究价值

通过利用乳酸产生菌产生的乳酸可以和Gpr81互作刺激Wnt3的分泌，作者提出可以利用乳酸产生菌类型的共生菌或者乳酸来保护因放射治疗和化学疗法带来的肠道损伤，可以在临床预防方面发挥作用

参考文献

[1] https://baike.baidu.com/item/肠道干细胞/426160
[2] http://www.360doc.com/content/18/0307/03/33459258_735001958.shtml
[3] Lactobacillus accelerates ISCs regeneration to protect the integrity of intestinal mucosa through activation of STAT3 signaling pathway induced by LPLs secretion of IL-22 (https://www.nature.com/articles/s41418-018-0070-2)
[4] Microbiota-Derived Lactate Accelerates Intestinal Stem-Cell-Mediated Epithelial Development (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312818305596)

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