LncRNA设计原则
LncRNA的引物设计跟mRNA的引物设计类似，都遵循以下规则：
1.引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2.扩增产物长度在 80-150bp。最长不要超过 300bp。
3.产物不能形成二级结构(自由能小于 58.61KJ/mol)。
4.引物长度:一般在 17-25 碱基之间,上下游引物不宜相差太大。
5.引物自身不能有连续 4 个碱基的互补,避免形成发卡结构。
LncRNA引物设计
我们通过在线工具Primer3Plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)来设计引物，下图为Primer3Plus的网页界面：
这里我们首先需要设置General Settings,需要设置的参数:
Procuct Size Ranges:100-150bp
Primer Size:18-25bp
Primer Tm:58-60
Primer GC:45%-55%
设置完成后点击Load Settings,然后开始输入LncRNA的fasta序列，我们输入一个annotated的LncRNA序列：
>ENST00000487094.1
GAGCAGGGAGGCTGCGGTGGATCAGCTGCCTGCTGTCTCTGACTGGAAGCCACTACCTTTAGGGCAGGGACTCCGACTACTTCACTCGCCACCGGATCATCTGGGTTTTGAAGAAACCAAGATGCCTTTCATTAATTCTTCCAACTAAATTAATGGAGTCACTGCATCTCGAACACCATTAGCAGAGCAGAGACAAGAGTTTTGGCTGGAAAAGGGTTCCTGCTTTTTTATCTTCTTCATTTTCTCTTGCCACCACCATGTAAGAAGTGCCTTTCACCTCCCACGATGATCCTGAGGTCTCCCCAGCCATGTGGAACTATGTGCACAATCATTATCACTGATGTACCTGTGTCTTCAGCCTGTTTGACTACACTGGGGTGAGGACGTTGTGGAACAGATGGATTATTATCTACCTGGGCTCACACAGCTAGGAGGTGATAAAGGAAAGAAGCAGCATGTAGCCATTGGACCCAACCCCTCAGCCACTGTAGAGCTTGAGAGAGCTGGATCTCTCCAAGTTATATCCAGCTTTTTAATTATCTGACAAAGGAGAACATGAAGGATGAATTCCATCATCACCAAAAAGTCATAGTGATATTAACACATGCCCTGATAACCTGAGAAAACTGCTGTGAAACCAGAGAACAGTTTGATAATGAGCCTGGGACATATACAAGAAAACCTGAGCTATAGAGTGAGTGTCTGCAAAGGCCGAGAGGGCTCCCACTATGTTCATTCTCCTGGAGGTTGCTTTTATCCAACTCACAGTTGCTTCTTTTGCTCTTTATGGAGGTGTTTGGAAATCTTGAAATTCTTAAGGTTGCTTTGACCTTCTTAGATGAAA
然后点击绿色的Pick Primers,就能得到以下的引物序列：
这里一共出来了5对引物，我们随便选择一条LncRNA的引物，这里我们选择第一条引物：
TCCCACGATGATCCTGAGGT
TGTTCCACAACGTCCTCACC
LncRNA引物特异性分析
网页工具：NCBI Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)
1.将上下游引物复制过去
2.勾选Standard databases(nr etc.):选项
3.物种选择human (taxid:9606)
4.勾选Somewhat similar sequence(blastn)选项
5.点击BLAST
然后得到以下结果：
发现与AC011294.3匹配度为100%，与其他的最多为52%，而我们的LncRNA注释为AC011294.3，所以引物设计没有问题！